血浆凝固酶试验操作步骤

【原理】
病原性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原变为不溶性纤维蛋白，附于细菌表面，生成凝块，因而具有抗吞噬的作用。凝固酶试验对于判定该菌株是否具有致病力，很有帮助。葡萄球菌凝固酶试验被广泛地用于常规鉴定金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌。

葡萄球菌所产生的凝固酶有两种：结合凝固酶和游离凝固酶。

结合凝固酶（即凝聚因子）：是一种结合于菌体细胞壁的酶，它直接作用于血浆中纤维蛋白原，使之变成纤维蛋白，而使葡萄球菌凝集成块，玻片法阳性结果是由此酶（凝聚因子）所致。

游离凝固酶：是凝血酶原样物质，不直接作用于血浆纤维蛋白原上，而被血浆中的致活剂（即凝固酶致活因子）激活后，变成耐热的凝血酶样物质，此物质可使血浆中的液态纤维蛋白原变为固态纤维蛋白，从而使血浆凝固。试管法的阳性结果为此酶所致。

【方法】
（1）玻片法：在1张洁净玻片中央加1滴9g／L氯化钠(生理盐水)溶液，用接种环取待检培养物与其混合（设阳性和阴性对照）制成菌悬液，若经10～20s内无自凝现象发生，则加入兔新鲜血浆1环，与菌悬液混合，观察结果。
（2）试管法：用生理盐水将新鲜兔血浆4倍稀释，取0．5ml于试管再加0.5ml待测菌浓菌悬液（需做阳性对照及阴性对照。），混匀后置37℃水浴中，每30min观察1次结果。若3小时内试验管和阳性对照管出现凝固，阴性对照管（即浓菌液管）不凝固，为阳性；若阴性，继续观察到24小时，不凝固者为阴性。

【结果判断】
（1）玻片法：5～10s内出现凝集者为阳性。
（2）试管法：如有凝块或整管凝集出现为阳性。4h后无上述现象出现，则放置过夜后再观察。

【应用】
本试验仅用于致病性葡萄球菌的鉴定。

【注意事项】
（1）玻片法：10秒内观察结果，如超过10 秒可出现假阳性，因此必须用试管法验证凝聚因子试验。

（2）可选择的玻片凝集试验法还包括检测凝集因子和蛋白A的胶乳凝集试验。但胶乳凝集试验和玻片凝固酶试验的结果并不完全一致。尽管胶乳凝集试验鉴定路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis）的可靠性较差，但鉴定金黄色葡萄球菌的特异性和灵敏性均高于传统的玻片凝固酶试验。有些腐生葡萄球菌和松鼠葡萄球菌及某些微球菌属的菌种可能胶乳凝集试验阳性，但玻片凝固酶试验通常阴性。

（3）试管法：须制备浓厚的均匀菌悬液，以便观察结果。
a.试管法葡萄球菌凝固酶试验阳性者，应见到明显的纤维蛋白凝胶块，出现羊毛状或纤维状沉淀物并非真正凝固，应判为阴性。中间型葡萄球菌、猪葡萄球菌需要较长时间（4H以上）孵育，才可出现阳性。
b.如果培养时间超过4H，应考虑以下几点：
Ⅰ.延长培养时间后，有些菌株产生的葡萄球菌激酶（溶纤维蛋白酶），可以裂解凝块，产生假阴性结果；
Ⅱ.如果使用的血浆不是无菌的（或部分不是无菌的），假阳性和假阴性结果均有可能发生；
Ⅲ.所用待测菌不纯，延长培养时间后，污染菌可能导致假阳性结果。在这点上，含EDTA的血浆优于柠檬酸盐血浆，因为利用柠檬酸盐的细菌（如一些链球菌）可能通过消耗柠檬酸盐促进凝集发生。
Ⅳ.所用血浆缺乏纤维蛋白原（脱纤维血浆）。

（4）最好用EDTA抗凝的兔血浆，不主张用人的抗凝血，除非经过试验证实其中不含感染因子、没有凝血能力和没有抑制因子。不同种动物血浆因子不同，凝固状态也不同，兔血浆凝块结实，凝固速度快，优于人血浆。

（5）试验不可在高盐培养基上的取菌落，因为可能出现自凝或假阳性。

（6）若被检菌为陈旧的肉汤培养物（超过18～24H），或生长不良，凝固酶活性低的菌株可能检测不出来。

(7)为防止玻片法检测的假阳性反应，必须严格按《全国临床检验操作规程》进行操作。当怀疑待测菌是金黄色葡萄球菌时，对玻片凝固酶阴性的结果应做试管法凝固酶试验确证。玻片法和试管法凝固酶试验的血浆标准是:必须含有足够浓度的凝固酶反应因子和纤维蛋白原，必须无溶纤维蛋白活性和无抑制剂。

附：
1.玻片法检测血浆凝固酶阳性的菌有：金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、里昂葡萄球菌（即：路邓葡萄球菌Staphylococcus lugdunensis）、施氏葡萄球菌凝聚亚种（Staphylococcusschleiferi ssp. coagulans）及部份中间型葡萄球菌（staphylococcusintermedius）。

2.试管法检测血浆凝固酶阳性的菌有：金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、施氏葡萄球菌凝聚亚种（Staphylococcusschleiferi ssp. coagulans）、中间型葡萄球菌（staphylococcusintermedius）、海豚葡萄球菌(Staphylococusdelphini)及部份猪葡萄球菌（staphylococcushyicus)。

3.我做的试管法试验图：
左：测定管(阴性)，右：标准金葡菌株(阳性)

4.关于路邓葡萄球菌Staphylococcus  lugdunensis）：菌落直径常为4～7MM，平滑，有光泽，可能无色素沉着或呈现奶油色至橘黄色。边缘完整，相当扁平，中心呈轻微圆锥状凸起。玻片凝固酶试验（+）。可分解海藻糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖且产酸，不分解甘露醇且不产酸。PYR（pyrrolidonase：吡咯烷酮基芳胺酶）(+)、ODC（+）（培养8H观察，此时表皮葡萄球菌为阴性。）。

5.关于施氏葡萄球菌（Staphylococcus schleiferi ssp.）：菌落直径常为3～5MM且无色素沉着，光滑有光泽，轻微凸起，边缘完整。玻片凝固酶试验（+）。PYR（pyrrolidonase：吡咯烷酮基芳胺酶）(+)。可分解甘露糖，有时也分解海藻糖而产酸，但不分解甘露醇、麦芽糖或蔗糖。