特殊培养法

1）二倍体细胞培养法

二倍体细胞培养法与一般培养相同，关键在于传代，其传代程序为：

1.      吸除旧培养液注入另瓶中。

2.      用温BSS冲洗1次。

3.      用0.25%温胰蛋白酶消化，加入消化液量以仅覆盖细胞层即可；作用1~5分钟。

4.      待细胞附着松动、细胞质边缘卷起和间隔加大，便终止消化。为防止细胞丢失，可不必再用BSS冲洗，直接向瓶中加入培养液（新旧培养液按2：1新旧混合）。

5.      轻轻反复吹打制成单个细胞悬液。

6.      按一分为二比例接种培养。

2）支持物培养法

加支持物培养法与一般培养法相同，只是在培养前需在培养瓶中加入已经消毒的支持物。

1.      支持物制备：如用特氟隆薄膜，无菌条件下启封，用剪刀按需要剪成各种不同大小的块，于培养接种细胞前，先置入培养容器中即可；通常多用盖玻片做支持物，用前先要把盖片用玻璃刀切成一定形态，以便装入培养瓶中，然后按如下顺序处理：自来水浸泡24小时—96%酒精30～60 min—蒸馏水浸泡30～60 min—用干净软布擦拭干净—装入培养皿中—高压或干热灭菌备用。

2.      培养法：初代消化培养、初代组织块培养、传代培养等皆可应用加支持物培养法。接种细胞后，可在任何时间取出支持物，做各种观察或实验。

3）细胞分离（克隆）培养

多孔塑料培养板单细胞克隆法：

1.      消化：取健康待克隆细胞，吸出瓶内培养液，加消化液。

2.      低密度细胞悬液的制备：做克隆细胞时首先需先用消化法制备出分散成单个细胞悬液，然后稀释细胞，使之成为1~2细胞/毫升悬液，最适宜细胞密度为1~2细胞/ml培养液。

3.      接种：先用吸管轻轻吹打细胞悬液，使混悬均匀，继用加样器向塑料培养板每孔内加0.5毫升。接种时要迅速准确，争取在最短时间内加完，以免培养液蒸发，然后迅速盖好盖板，置CO₂温箱培养。

4.      标记：培养6~12小时后，待细胞下沉冰贴附于培养板孔底后，从温箱中取出，置倒置光显微镜台上，观察和标记下含有单个细胞的孔，置CO₂温箱培养。在培养中一般无需换液，只有在细胞增长过于缓慢时才可进行换液。换液时先吸除旧培养基，但不要吸除过多，余少许，以免细胞干涸。然后再迅速补加新鲜克隆培养液，继续培养3~4周。待孔内细胞增至500~600个时，可进行分离培养。

5.      分离扩大培养：培养86~96小时后进行观察。挑选生长良好的单细胞克隆孔，先吸除旧培养液，用Hanks洗1~2次，继加胰蛋白酶少许，加入量已能覆盖细胞群即可，如过多，应吸除多余消化液。置于倒置显微镜下窥视，待发现细胞变圆时，加入0.1ml含10%血清的克隆培养基，用吸管轻轻吹打，当细胞离开底物悬浮后，一并吸入管内，移入另瓶或皿中，再补加一定量克隆培养液，置CO₂温箱中继续培养、增殖，使之形成新的细胞群后，即转用常规培养法培养。

必须保证分离出来的细胞确为一个而不是两个或更多。因此必须提高克隆形成率才易克隆成功，为此常采取以下一些措施：

使用适应性培养基或条件培养基（Conditional Medium）。制备方法：

1.      培养同源细胞（未克隆前时的同一细胞）至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养24~48小时后，吸出所有培养液。

2.      离心：3000~4000/分离心10分钟，吸取上清液。

3.      滤过：再经直径0.22μm滤孔的滤膜过滤，低温冻存贮备用；用时取1分适应培养基+2分培养基混合使用。

使用饲细胞(Feeder Cells)。制备方法：

1.      取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90%汇合时制成细胞悬液，再按10⁵细胞/毫升重新接种培养。

2.      在细胞半汇合时，准备0.25μg/ml的丝裂霉素C，按2μg/10⁶细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用射线单次照射，剂量30～50戈瑞。

3.      细胞经上述处理后，Hanks液漂洗两次、更换培养液、再培养24小时，胰蛋白酶消化细胞制成悬液，按5×10⁴（10⁴细胞/cm²）接种入新培养基中。

4.      48小时后，即可用于细胞克隆之用。

底物特殊处理：

1.      制备浓度为1 mg/ml的多聚右旋赖氨酸的水溶液，用以湿润培养瓶底。

2.      倒出多聚赖氨酸溶液，用5ml PBS冲洗一次后，可立即使用，或存数周内使用。

4）球体细胞培养

1.      琼脂铺底的培养瓶：30ml无菌培养瓶，每瓶中加5 ml 2%琼脂培养基，冷却，形成平坦底层后备用。

2.      取生长状态良好已连接成片的细胞，用弯头吸管伸入瓶内，把细胞纵横割划成若干小区后，倒出培养液。

3.      加入0.25%的胰蛋白酶液，在倒置显微镜下边消化边观察，当细胞小区边缘微卷起后便立即终止消化，倒出消化液，用Hanks轻轻漂洗一次，加入新培养液3~5 ml，用吸管把已松动的细胞片吸打下来，分装入1~3个含2%琼脂培养基底层的培养瓶中，置温箱继续培养，数日后便可生长成细胞球体。

4.      换液：培养1~2日后，如需换液，微倾斜培养瓶，令培养液集于培养瓶底角，停片刻，待球体细胞下沉后，吸除部分培养液，再补充新培养液。

5）微载体细胞培养法

1.      微载体选择：先用利用三种小量微载体做培养实验，观察细胞在一定时间内细胞的吸着率和计算细胞数，以得到最大量细胞为佳。

2.      水化：称一定量的微载体放入容器中，按每克微载体加50～100ml的比例，加入无Ca^2＋和Mg^2＋的磷酸缓冲液（PBS），室温下放置应不少于3小时，并不时轻微搅动，然后再用新鲜PBS洗一次。

3.      消毒：可采用高压蒸汽消毒，也可在水化后用70％酒精浸泡消毒，再用无菌的PBS漂洗一二次。

4.      传代培养：在连续进行微载体培养时，可以不必把细胞从微载体分离下来，可将带有细胞的微载体和新的微载体混合进行培养细胞能移动到新载体上。如果进行其它实验或需要分离细胞进行传代培养时，和常规培养相同，先用EDTA＋胰蛋白酶溶液作用使细胞脱离微载体表面。细胞脱离微载体后，可用自然沉降法，即在室温下静止5分钟，微载体将先自沉在底部，细胞大部分仍在上清中，然后离心上清即可得到细胞。如果需要分离程度较高时，需用孔径为100微米的尼龙网或不锈钢网过滤后，再离心滤过液，就可得到较纯净的细胞。

6）悬浮培养法

悬浮培养是使帖壁细胞呈悬浮状态生长。如所需培养的细胞本身属悬浮生长型，则无须做任何处理；在传代时先做离心处理去除旧培养液，添加新培养液即可。但在培养帖附型细胞时，必须进行干扰细胞不能帖附，方法有二：

1．用大培养瓶增加含有铁芯的无毒的聚苯乙烯棒，在培养中进行电磁搅拌，使细胞不能帖壁而成悬浮培养。

2．用试管培养细胞，把试管置入带有旋转鼓的特制温箱中进行培养，旋转鼓不停徐缓转动，干扰细胞帖壁遂成悬浮培养。