细菌培养

(一) 病料采集和运送　对动物进行病原菌检疫，病料的采集和运送是否得当，是关系到能否分离到病原菌的关键。首先充分了解各种病原菌（目的菌）在被检动物体内及其分泌物和排泄物中的分布情况，不同的病原菌在患病动物体内分布情况不同，即使是同一种病原菌，在病的不同时期和不同的病型中分布也不同。在采取病料前必须对被检动物可能患有何种疫病作出初步诊断。采取病料所用器械和宣传品器都应事先消毒，确保无毒，采样时应无菌操作。如果动物已死亡，取样应注意以下几点：⑴ 对急性死亡的动物，从耳尖或四肢末梢血管取血制成涂片，染色镜检，在排除炭疽后方能剖检取样；⑵ 采取病料时间，原则是越早越好，夏季要在动物死亡后2小时内采取病料；⑶ 为了提高病原微生物的阳性分离率，采取的病料要尽量可能齐全，除了内脏、淋巴结和局部病变组织外，还应采取脑组织和骨髓，以防遗漏；⑷ 认真填写好病料送检单和剖检病理变化记录。下面介绍病料的采取方法。

1. 脓汁　先将表面流水线，然后以灭菌注射器或吸管抽取深部的浓汁；若是开口化脓灶或皮肤、粘膜表面化脓，可用灭菌棉拭子浸沾脓汁后，放入试管中。

2. 内脏器官　采取心、肺、肝、脾、肾等有病变的组织及其淋巴结，无病变时也要采取，无菌剪取1－2cm大的方块，分别装入灭菌容器内。

3. 血液　要全血时，无菌采取血液10m，立即注入盛有含0.5％肝素溶液0.1ml或5%柠檬酸钠液1ml的灭菌试管内，并立即混合均匀。要分离血清时，将无菌采取的血液直接注入灭菌试管，待血液自然凝固后分离血清。从尸体采取血液时，可用灭菌注射器或吸管从右心房抽取。

4. 皮肤和粘膜　采取病变局部的皮肤和粘膜及其所属淋巴结，放入甘油盐水溶液中。

5. 脑和脊髓　无菌采取脑的脊髓约1－2cm大的方块，放入甘油盐水溶液中。

6. 胆汁　用灭菌注射器抽出后放入灭菌试管中。

7. 肠和胃　剪取有病变的部位一段或一块。也可将肠管一段（约6－8cm）用线扎紧两端后剪下送往实验室。

8. 粪便　可用棉拭子插入肛门沾取，或扑杀病畜后由肠管采取，立即放低温条件下保存。

9. 乳汁　先用消毒药液洗净乳头及其附近，弃去最初挤出的几滴乳汁，然后采取乳汁约10ml放入灭菌试管内。

10. 流产胎儿　可将整个胎儿用塑料薄膜包紧，装入箱中送检。

11. 小动物、禽和鱼等可按上述流产胎儿方式整体送检。在距离实验室很近，又有隔离运输条件时，也可将发病小动物直接送检。

(二) 病料的处理　采集的病料，在接种培养前，应对其性状进行观察，例如：是否脓性带血或腐败，有何异味，并作记录。各种病料在分离培养前均应制备一张涂片，作革兰氏染色、镜检，以了解细菌的形态、染色特性，并大致估计其含菌量。通过肉眼观察和显微镜下看到的结果，对病料中可能含有的病原菌作最初步的估价。

如果病料是病变组织，又是用无菌方法采集的，在接种前一般无需作特别处理。但如果病料被杂菌污染严重，则需根据要分离的病原菌的特性，采用一些对病原菌无害，但对杂菌有杀灭或抑制作用的方法，以抑制杂菌生长。例如从粪便中分离沙门氏杆菌，可将粪合接种于亚硒酸钠肉汤中，作增菌处理。在这种培养基中，其它杂菌被抑制，而沙门氏杆菌则能自由繁殖。又如，分离布鲁氏杆菌、胎儿弯曲杆菌、炭疽杆菌、副结核杆菌可用选择性抗菌琼脂。分离链球菌和猪丹毒杆菌用叠氮钠结晶紫血琼脂等。如果从肠道内容物或从污染有不产生芽胞的杂菌培养物中分离能形成芽胞的细菌（如魏氏梭菌、破伤风梭菌等），可将病料在80℃加热15分钟，以杀死不形成芽胞的杂菌，取此材料再接种培养基，即容易获得纯培养物。有些病料（如奶、尿等）含菌太少，则应先作集菌处理，然后接种，以提高检出率，其集菌方法有离心法和过滤法。离心法取沉淀物作培养物；过滤后取沉积于滤板上表面的病料作培养。还有些细菌往往在细胞浆内集结成团，在它们所形成的病灶中含菌较少，遇到这种情况，可将病料组织磨碎，制成乳剂，加入酶、酸或碱，消化组织，使菌团散开，然后离心，收集沉淀物作培养（如从肠粘膜分离副结核杆菌即用此法）。

(三) 细菌的分离与接种　培养细菌时，须将标本或细菌培养物接种于培养基上，常用接种方法有以下几种。

1. 平板划线接种法　本法为最常用的分离培养细菌的方法，通过平板划线后，可使细菌分散生长，形成单个菌落，有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌。分离培养用的平板培养基应表面干燥，可于临用前置37℃孵育箱内30分钟，这样表面即干燥有利于分离培养，又使培养基预温，对培养某些较娇弱的细菌有利。常用的平板划线接种法有以下几种。

(1) 分区划线法　此法多用于脓汁、粪便等含菌量较多的标本的分离。其方法是首先将接种环灭菌后，沾取标本均匀涂布于平板培养基边缘一小部分（第一区），将接种环火焰灭菌，待冷却后只通过第一区3－4次后连续划线（为第二区），依次可共划线3－5区，每一区细菌数可逐渐减少，直到分离出单个菌落为止。

(2) 连续划线法　该法多用于含菌数量较少的标本。其方法是首先用白金耳将标本均匀涂布于平板培养基边缘一小部分，然后由此开始，在培养基表面自左向右连续划线并逐渐向下移动，直到下边缘。

划线接种时，尽可能作到直、密、匀，有效地利用培养基表面达到充分分离的目的。如果标本含菌较多，接种在强选择培养基（如SS琼脂）上时或标本含菌较少时，采用分区划线法接种，接种环可一直划完各区皿内，中间不必灭菌。

2. 斜面接种法　采用该法目的是进行纯培养。其方法是从平板分离培养物上用接种环挑取单个菌落或者是取纯种，移种至斜面培养基上，先从斜面底部自下而上划一条直线，再从底部开始向上划曲线接种，尽可能密而匀，或者直接自下而上划曲线接种。

3. 倾注培养法　此法适用于乳汁和尿液等液体标本的细菌计数。其方法是取原标本或经适当稀释（一般是10-1 －10-5倍稀释）的标本1ml，置于直径9cm无菌平皿内，倾入已融化并冷至50℃左右的培养基约15ml，立即混匀待凝固后倒置于37℃培养18－24小时，做菌落计数。

4. 穿刺接种法　本法多用于双糖、明胶等具有高层的培养基进行接种。方法是用接种针挑取菌落或培养物，由培养基中央直刺到距管底约0.3－0.5cm处。然后沿穿刺线退出接种针，若为双糖等含高层斜面的培养基则光穿刺高层部分，退出接种针后直接曲线接种斜面部分。

5. 液体接种法　本法多用于普通肉汤，蛋白胨、水等液体培养基的接种。其方法是接种环沾取菌种，倾斜液体培养基管，先在液面与管壁交界处研磨接种物（以试管直立后液体能淹没接种物为准），然后再在液体中摆动2－3次接种环,塞好棉塞后轻轻混合即可。

(四) 细菌的培养方法　根据培养细菌的目的和培养物的特性培养方法分为一般培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法三种。

1. 一般培养法　将已接种过的培养基,置37℃培养箱内18－24小时,需氧菌和兼性厌氧菌即可于培养基上生长。少数生长缓慢的细菌，需培养3－7天直至一个月才能生长。为使培养箱内保持一定湿度，可在其内放置一杯水。培养时间较长的培养基，接种后应将试管口塞棉塞后用石腊凡士林封固，以防培养基干裂。

2. 二氧化碳培养法　某些细菌，如牛流产布氏杆菌和胎儿弧菌等需要在含有10％二氧化碳的空气中才能生长，尤其是初代分离培养要求更为严格。将已接种的培养基置于二氧化碳环境中进行培养的方法即二氧化碳培养法，常用方法有以下几种：

(1) 二氧化碳培养箱　可将已接种的培养基直接放入箱内孵育，即可获得二氧化碳环境。

(2) 烛缸法　将已接种的培养基，置于容量为2 000ml的磨口标本缸或干燥器内。缸盖或缸口处均需涂以凡士林，然后点燃蜡烛直立置入缸中，密封缸盖。待燃自行熄灭时，容器内约含5－10％的CO2 容器置37℃培养。

(3) 重碳酸钠－盐酸法　每升容积的容器内，重碳酸钠与盐酸按0.4g与3.5ml的比例，分别将两种药各置一器皿内（如平皿内），连同器皿置于标本缸或干燥器内，盖严后使容器倾斜，两种药品接触后即可产生二氧化碳。

3. 厌氧培养法　目前常用的厌氧培养方法有厌氧罐法、气袋法及厌氧箱三种。

(1) 厌氧罐法　是目前应用较广泛的一种方法，共分为以下几种。

抽气换气法：该法适用于一般实验室，其特点是较经济并可迅速建立厌氧环境。标本接种后，将平板放入厌氧罐，拧紧盖子，用真空泵抽出罐中空气，使压力真空表至-79.98KPa，停止抽气，充入高纯氮气使压力真空表指针回0位,连续反复3次,最后在罐内-79.98KPa的情况下,充入70%的N2 、20%H2 、10%CO2 （有人改用20%CO2 及80%H2 ,亦可获得好结果）。罐中需放入冷催化剂钯粒，可催化罐中残余的O2 和H2 化合成水。同时罐中应放有美蓝指示管，美蓝在有氧的环境下呈蓝色，无氧时为红色。临用前首先将美蓝煮沸使变成无色，放入罐中先呈浅蓝色，待罐中无氧环境形成，美蓝即可持续无色。

气体发生袋法：气体发生袋系由锡箔密封包装，其中含有两种药片，一种为含枸椽酸和重碳酸氢钠的药片，另一种是含有硼氢化钠的药片。前者遇水放出二氧化碳，后者可释放氢。使用时在袋的右上角剪一小口，灌进10ml蒸馏水，立即放入含有钯粒、指示剂及平板培养基的厌氧罐中，拧紧盖子经2－3分钟后，可感到盖子微热并有少量水蒸气出现。密封后1小时左右罐中的O2 的含量可低于＜1%。

(2) 气袋法　此种方法不需要特殊设备，操作简单，使用方便，不但实验室中可用，而且外出采样、现场接种也可用。原理与气体发生袋完全相同，只是采用塑料袋代替了厌氧罐，气袋为一透明而密闭的塑料袋，内装有气体发生安瓿、指示剂安瓿、含有催化剂的带孔塑料管各一支。其操作方法为首先将接种的平板培养基放入袋中，用弹簧夹夹紧袋口，然后用手指压碎气体安瓿，20分钟后再压碎指示剂安瓿，如果指示剂不变蓝色，说明袋内达到厌氧状态，即可放入37℃进行培养。

(3) 厌氧培养箱　使用之前须仔细检查厌氧装备有无漏气等问题，以及催化剂、指示剂质量等。使用时严格遵守操作规程，保证箱内气体比例合理。

细胞培养常见问题及其解决

1. 如何选用特殊细胞系培养基？

培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。

2. 何时须更换培养基？

视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。

3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基？

不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。

4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？

不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。

5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。

6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？

一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞。

7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？

HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。

8. 细胞之接种密度为何？

依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。

9. 悬浮性细胞应如何继代处理？

一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可，若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。

10.冷冻管应如何解冻？

取出冷冻管后， 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。

11. 细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？

除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。

12. 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？

一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于–20 °C，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低，并可减少污染之机会。

13.欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？

欲回收动物细胞， 其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡。

14. 细胞冷冻培养基之成份为何？

动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。

15.DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？

冷冻保存使用之DMSO 等级， 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4°C，避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO， 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。

16.冷冻保存细胞之方法？

冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。

冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至–80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。

17. 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？

冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。

18.培养基中是否须添加抗生素？

除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。

19.应如何避免细胞污染？

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。

20.如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？

原则上：直接灭菌后丢弃之。

当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。

高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。

1.在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。

2.分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

3.每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。

4.确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2～3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2～3代。

5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代。

6.重复步骤4。

7.在无抗生素的培养基中培养4～6代，确定污染是否以已被消除。

21.支原体(mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？

不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。

22.支原体污染会对细胞培养有何影响？

支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。

23. 侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？

直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。

24. CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？

定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去